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Ni瓊脂糖凝膠操作說明書
更新時間:2021-04-14 點擊量:2167

Ni瓊脂糖凝膠說明書

Ni-Agarose Resin for 6×His-Tagged Proteins 

目錄號:  K0010       

    存:  20%乙醇中          2-8℃保存 

 

組分說明 

 

                     Cat.No.        K0010A         K0010C

                     Volume           10ml         100ml

 

產(chǎn)品簡介

 

      該鎳柱純化系統(tǒng)對6×His-tag 蛋白具有顯著特異吸附能力,能夠高效一步純化帶有 6 個組氨酸親和標簽的蛋白。該系統(tǒng)具有4 Ni2+ 螯合位點,較只有3 個螯合位點的Ni-IDA 結合Ni2+更為牢固,有效防止純化過程中Ni2+脫落且增強對His 標簽蛋白的結合能力,提高純化效率。較高的基團密度,大大提高了蛋白載量。該系統(tǒng)在天然或變性條件下,對來源于各種表達系統(tǒng)(如桿狀病毒,哺乳細胞,酵母以及細菌)中的 His 標簽蛋白,均有很好的純化效果。本產(chǎn)品已螯合鎳離子,可直接使用,方便,快捷。

支持物:CL-6B 瓊脂糖凝膠

      量:20-30mgHis標簽蛋白/ml 填料

      徑:50-160μm

 

注意事項 

 

 1. 緩沖液中不建議使用β-巰基乙醇、DTT EDTA

 2. 整個純化過程中切忌凝膠脫水變干。

 3. 為提高純化效率,首先確定BindingBuffer 和  ElutionBuffer 中咪唑的最-#佳使用濃度??梢允褂镁€性或梯度濃度的咪唑(20-500mM)洗脫蛋白,并通過SDS-PAGE WesternBlotting 來檢測目的蛋白的純度。

 4. 請使用高純度的試劑配制緩沖液,并通過0.45µm 過濾器過濾。為避免柱子被堵塞,建議將裂解液進行離心,或者使用 0.45µm 過濾器過濾。

 5. 柱再生時,保證每步洗完后都要用足夠的去離子水沖洗至中性。

 

操作步驟 

 

組裝層析柱 

 1. 將填料混勻后加入層析柱,室溫靜置10 分鐘,待凝膠與溶液分層后,把底部的出液口打開,讓乙醇通過重力作用緩慢流出。

 

 注意:(1)填料的上層是乙醇保護層,將填料和乙醇一起混勻,以每ml填料純化20-30mgHis標簽蛋白計算,取需要的填料與乙醇的混合液加入層析柱。

 

2)如果乙醇不流出,可以給柱子一個外力,例如用大拇指對柱口輕輕按壓一下,迫使乙醇流出。                                                        

3)本實驗都是通過重力作用使溶液流出。

 

 2. 向裝填好的柱中加入5 倍柱體積的去離子水將乙醇沖洗干凈后,再用 10 倍柱體積的Binding Buffer  平衡柱子,平衡結束后即可上樣。

 

 注意:柱體積指的是填料的體積。

 

可溶性蛋白的純化(SolubleBindingBufferSolubleElutionBuffer配方詳見附表1 

 1.  收集菌體后,每100mg菌體(濕重)加入1-5 ml細菌裂解液,超聲裂解菌體。

 2.  將菌體裂解液負載上柱,流速為10倍柱體積/小時。

 3.  使用15倍柱體積的Soluble Binding Buffer沖洗柱子,收集流穿峰。

 4.  使用5倍柱體積的Soluble Elution Buffer洗脫,收集洗脫峰。

 5.  洗脫后,依次使用3倍柱體積的Soluble Binding Buffer5倍柱體積的去離子水洗滌柱子,再用3倍柱體積的20%乙醇平衡(乙醇要將填料浸沒),4℃保存。

II  包涵體蛋白的純化(InclusionBodyBindingBuffer InclusionBodyElutionBuffer配方詳見附表2 

 1. 收集菌體后,每100mg菌體(濕重)加入1-5 ml  細菌裂解液,超聲裂解菌體。

 2. 離心,棄上清,將沉淀重懸于Soluble Binding Buffer中(如有需要,可進行超聲波處理,超聲前可加入1-5mM磷酸酶抑制劑混合物)。

 3. 重復操作2,直至包涵體清洗干凈(呈較潔凈的乳白色狀)。

 4. 將沉淀重懸于Inclusion BodyBinding Buffer中,冰浴1小時,使包涵體溶解。

 5. 10,000×g離心20分鐘,將上清以孔徑為0.45 μm的濾膜過濾。

 6. 將蛋白溶液負載上柱,流速為10倍柱體積/小時。

 7. 使用15倍柱體積的Inclusion BodyBinding Buffer沖洗柱子,收集流穿峰。

 8. 使用5倍柱體積的Inclusion Body Elution Buffer洗脫,收集洗脫峰。

 9. 洗脫后,依次使用3倍柱體積的Inclusion BodyBinding Buffer5倍柱體積的去離子水洗滌柱子,再用3倍柱體積的20%乙醇平衡(乙醇要將填料浸沒),4℃保存。

 

     注意:在純化包涵體蛋白時,所有緩沖液均含有變性劑,需要降低 BindingBuffer 中的咪唑濃度(5mM 或更低)。洗脫時,若蛋白在較高pH下洗脫失敗,可以選用低 pH 緩沖液作為洗脫緩沖液(pH6.5,pH5.9 pH4.5)。 柱再生 當填料使用多次后,結合效率會有所下降(表現(xiàn)為流速變慢或填料失去藍綠色),可以用以下方法再生,提高填料的使用壽命和蛋白質的結合效率。

 1. 使用2 倍柱體積的6M  鹽酸胍沖洗后,使用3 倍柱體積的去離子水沖洗。

 2. 使用 1 倍柱體積2% SDS 沖洗。

 3. 依次使用 1 倍柱體積的25%、50%、75%5 倍柱體積100%乙醇沖洗,再依次使用 1 倍柱體積的75%、50%、25%的乙醇沖洗。

 4. 使用 1 倍柱體積的去離子水沖洗。

 5. 使用 5 倍柱體積含50 mM EDTA 緩沖液(PH8.0)沖洗。

 6. 使用 3 倍柱體積去離子水,3 倍柱體積20%乙醇沖洗。

 7. 4°C 保存。

 

 8. 再次使用前,需首先使用10 倍柱體積去離子水沖洗,然后使用5 個柱體積的      50 mM NiSO4再生,3 個柱體積的Binding Buffer   平衡。

 1: 蛋白分子量標準  

(分子量由大到小分別為:90/66/45/27/  14.4kDa

2: 全菌裂解液

 3: 流穿收集液

 4: 洗脫收集液    

1(洗脫緩沖液,含     500mM   咪唑,收集第1 個柱體積)

 5: 洗脫收集液

2(洗脫緩沖液,含 500mM 咪唑,收集第 2 個柱體積)

 6: 洗脫收集液

3(洗脫緩沖液,含500mM咪唑,收集第3 個柱體積)

7: 洗脫收集液

 4(洗脫緩沖液,含500mM 咪唑,收集第 4 個柱體積)

 

 附表 

 

 附表  1. 可溶性蛋白純化緩沖液配方

                                                         

成分                    Tris-HClPH7.9)   咪唑            NaCl

 

SolubleBindingBuffer              20mM      10mM       0.5M

 

SolubleElutionBuffer              20mM        500mM     0.5M



 

    

附表  2. 包涵體蛋白純化緩沖液配方

 成分                 Tris-HClPH7.9)    咪唑    NaCl     尿素/鹽酸胍

 

InclusionBodyBindingBuffer      20mM     5mM  0.5M    8M/6M

InclusionBodyElutionBuffer       20mM   500mM   0.5M    8M/6M

 

    

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