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酶聯(lián)斑點(diǎn)(Elispot)實(shí)驗(yàn)服務(wù)

酶聯(lián)斑點(diǎn)(Elispot)實(shí)驗(yàn)服務(wù)

產(chǎn)品型號(hào):

所屬分類:免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)

產(chǎn)品時(shí)間:2024-08-30

簡(jiǎn)要描述:酶聯(lián)斑點(diǎn)(Elispot)實(shí)驗(yàn)服務(wù)
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詳細(xì)說明:

酶聯(lián)斑點(diǎn)(Elispot)實(shí)驗(yàn)服務(wù)

 

 

酶聯(lián)斑點(diǎn)(Elispot) 技術(shù)概述:

  酶聯(lián)斑點(diǎn)(Elispot) 全名為酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)檢測(cè),英文: Enzyme-linked Immunospot Assay.它結(jié)合了細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)與酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)(即ELISA技術(shù)), 能夠在單細(xì)胞水平檢測(cè)細(xì)胞因子的分泌情況。其技術(shù)原理,一句話概括就是:用抗體捕獲培養(yǎng)中的細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子,并以酶聯(lián)斑點(diǎn)顯色的方式將其表現(xiàn)出來。

 

 

1、實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)備工作

(1)設(shè)備與耗材:

①超凈工作臺(tái);

②5% CO2 37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱;

③P20,P200, P1000 微量移液器,

④P300 8通道微量移液器,P300 12通道微量移液器,

⑤Biosys ELISPOT Reader

⑥P20,P200, P1000 槍頭;

⑦多道移液器吸槽;

⑧0.5mL, 1.5mL EP管。

 

(2)溶液配制

①PBS:用分析純?cè)噭琈illipore級(jí)別的純水配制, 高壓滅菌。

②PBST: PBS加入0.05% Tween-20,注意無菌操作。儲(chǔ)存于20-25°C, 可存放一個(gè)月。

③70%乙醇:分析純乙醇70mL,加入Millipore級(jí)別的純水至100mL。

④30%乙醇:分析純2醇30mL,加入Millipore級(jí)別的純水至100mL.

⑤包被抗體(coating antibody, Primary antibody): 照U-Cytech說明書,加入雙蒸水溶解。使用時(shí),用PBS稀釋50倍,每孔50uL。

⑥封閉液:用PBS將試劑盒中的封閉存儲(chǔ)液(Blocking stock solution R)稀釋10倍,每孔200uL。

⑦抗體稀釋液:注意,只是用來稀釋檢測(cè)抗體和酶聯(lián)親和素。用PBS將試劑盒中的稀釋存儲(chǔ)液(Dilutionbuffer R)稀釋10倍

⑧檢測(cè)抗體(Biotinylated detector antibody, Secondary antibody):照U-Cytech說明書, 加入雙蒸水溶解。使用時(shí),用抗體稀釋液稀釋100倍,每孔100uL。

⑨酶聯(lián)親和素(Streptavidin-HRP conjugate):照U-Cytech說明書,加入雙蒸水溶解。使用時(shí),用抗體稀釋液稀釋100倍,每孔100uL。

D AEC顯色液: 照U-Cytech說明書, 用100mL 30%乙醇溶解底物緩沖液膠囊(Substrate bufercapsule),然后加入3.3mL AEC儲(chǔ)存液(AEC stock solution),混合均勻后10ml每支分裝,-200C保存。

使用時(shí),解凍,每孔加入100pL.

①PHA刺激物:將儲(chǔ)存液(2mg/ml,Murex)分裝成20μL/EP管, -20*C長(zhǎng)期凍存。 使用時(shí),加入980μLU-Cytech無血清培養(yǎng)基(或者1640基本培養(yǎng)基),成為工作液(40μg/mL,10倍終濃度),每孔加入10μL, 終濃度4μg/mL。

②U-Cytech無血清培養(yǎng)基:我們推薦無血清ELISPOT技術(shù),它能排除血清的干擾,結(jié)果更加穩(wěn)定可靠,背景也更好。如果沒有,可以用含10%血清的1640培養(yǎng)基代替。

2、ELISPOT標(biāo)準(zhǔn)操作程序

(1)第—天: ELISPOT包被程序設(shè)計(jì)好試驗(yàn),把每個(gè)孔要加入的內(nèi)容做成卡片,到時(shí)候就會(huì)從容很多。每孔加入15μL 70%的醇預(yù)濕30秒。

注意:

①未潤濕的PVDF膜是潔白的、不透明的,經(jīng)過乙醇潤濕之后,顏色變暗,變成半透明狀,很容易觀察二者的區(qū)別。

②加乙醇的時(shí)候,槍頭應(yīng)該靠在孔壁接近孔底的地方,注意槍頭不到刺到PVDF膜。

③有時(shí)候,加入的乙醇掛在孔壁上, 這時(shí)要蓋上板蓋,輕輕叩擊,讓乙醇順勢(shì)滑落。乙醇一 旦接觸到PVDF膜,就會(huì)在表面張力和毛細(xì)作用之下迅速浸潤整塊膜,使得膜的顏色和透明度發(fā)生變化。

④15μL 是經(jīng)過優(yōu)化的體積,它能保證剛好*浸潤整塊膜,而不會(huì)有剩余。如果加大使用量,乙醇溶液就會(huì)透過膜而積存在膜的背面,加深實(shí)驗(yàn)的背景。

⑤加入100μL去離子水洗滌三次,盡量減少乙醇的殘留。

⑥按照試劑盒的使用說明,將包被抗體儲(chǔ)存液稀釋在PBS緩沖液中,每孔加入50μL,4°C包被過夜。

⑦(次日)傾倒包被液,用PBS洗滌5次,后一次,在滅菌的吸水紙上扣干。

⑧加入200μL試劑盒自帶的稀釋好的封閉液,37°C封閉1小時(shí)。

⑨傾倒封閉液,無須洗滌,直接可以進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。(也可以用PBS緩沖液或者純水洗滌- -次, 拍干,封口,4°C保存,可以在4°C保存數(shù)周。)

 

(2)第二天:鋪細(xì)胞,加入刺激物,培養(yǎng)

①整個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)置-組正對(duì)照(PHA刺激), 每一個(gè)細(xì)胞樣品(同-個(gè)捐獻(xiàn)者或者實(shí)驗(yàn)動(dòng)物)要設(shè)一個(gè)負(fù)對(duì)照

(不加刺激物),整塊板還要加一個(gè)背景負(fù)對(duì)照(不含細(xì)胞,只加培養(yǎng)基和所有的檢測(cè)試劑)。

②填好實(shí)驗(yàn)卡片,用以指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)的安排和細(xì)胞及試劑的添加。每一個(gè)細(xì)胞/刺激物的組合設(shè)置2-4個(gè)孔的重復(fù)(想要有統(tǒng)計(jì)學(xué)的意義,每個(gè)細(xì)胞/刺激物設(shè)4個(gè)孔的重復(fù))。

④取出封閉好的板,準(zhǔn)備加入細(xì)胞。如果是以前做的封閉,可以加入200μL 的U-Cytech無血清培養(yǎng)基,室溫靜置10分鐘,傾倒,然后再重復(fù)- -次。

⑤按照實(shí)驗(yàn)卡片的安排,加入不同濃度的細(xì)胞,100uLwell, 細(xì)胞在孔中的分布要盡量均勻(要訣是加入

細(xì)胞之后,不要再震動(dòng)或者拍擊ELISPOT板。有人認(rèn)為拍擊板子會(huì)讓細(xì)胞更分散,實(shí)際情況剛好相反)。正對(duì)照的細(xì)胞濃度為1x105/well,實(shí)驗(yàn)組的樣品細(xì)胞濃度請(qǐng)自行調(diào)整。

⑥加入100μL的U-Cytech無血清培養(yǎng)基到背景負(fù)對(duì)照孔。

⑦正對(duì)照孔加入10μL PHA,終濃度4ug/mL,該濃度能有效刺激IFN-V的分泌。

⑧加入實(shí)驗(yàn)者自己的刺激物(配制成10X終濃度,10uLwell)到實(shí)驗(yàn)孔。 加完刺激物之后不要再拍擊ELISPOT板。有人認(rèn)為拍擊板子會(huì)讓刺激物在孔中混合均勻,實(shí)際上,通過擴(kuò)散,刺激物也會(huì)很快混合均勻。拍擊板子會(huì)讓細(xì)胞成圈的分布在孔的外周。

⑨當(dāng)加完所有的樣品之后,蓋上板蓋,放入二氧化碳培養(yǎng)箱,37°C培養(yǎng)18-24小時(shí)。 注意在整個(gè)培養(yǎng)過

程中避免移動(dòng)、碰撞培養(yǎng)板。為了取得更好的結(jié)果,甚至開關(guān)培養(yǎng)箱的箱[ ]也應(yīng)該禁止。因?yàn)榕鲎矔?huì)造成細(xì)胞的移位,造成斑點(diǎn)的模糊、拖尾。

 

(3)第三天:培養(yǎng)后操作

①傾倒孔內(nèi)的細(xì)胞及培養(yǎng)基。

②低滲法將細(xì)胞裂解,每孔加入200μL冰冷的去離子水,將板置于冰上冰浴10分鐘。

③每孔用200μLPBST洗滌10遍,洗滌后- 遍之后,將板倒扣在吸水紙上拍干。

④按照試劑盒說明的濃度,用抗體稀釋液稀釋檢測(cè)抗體,每孔加入100μL生物素標(biāo)記的檢測(cè)抗體,37°C 1小時(shí)。

⑤每孔用200μL PBST洗滌5遍,洗滌后一遍時(shí), 將PVDF膜板的背面的塑料保護(hù)層取下,同時(shí)洗滌膜的正反兩面,蓋上保護(hù)層,將板倒扣在吸水紙上拍干。

 

注意:

①洗滌膜的背面,我們摸索出的辦法是,在-個(gè)淺托盤中盛上干凈的PBST,將膜板的底面浸入,輕輕搖晃幾次即可。注意,-定要將膜的背面和塑料保護(hù)層上的液體甩干之后,再合攏,蓋上,不要傷害到膜。

②按照試劑盒說明的濃度,用抗體稀釋液稀釋酶標(biāo)的鏈霉親和素,每孔加入100L, 37°C 1小時(shí)。

③每孔用200μL PBST洗滌5遍, 洗滌后-遍時(shí),將PVDF膜板的背面的塑料保護(hù)層取下,同時(shí)洗滌膜的正反兩面,蓋上保護(hù)層,將板倒扣在吸水紙上拍干。

④照試劑盒的說明,解凍已配好的AEC顯色液。每孔加入100μL的顯色液,室溫靜置20-30分鐘,注意避光。

⑤待斑點(diǎn)生長(zhǎng)到適合的大小之后,以去離子水洗滌2遍,終止顯色過程。將板倒扣在吸水紙上,拍干細(xì)小的水珠,之后取下保護(hù)層,放在通風(fēng)的地方,室溫靜置10-30分鐘,讓膜自然晾干。注意不要將板放到烤箱內(nèi),防止膜發(fā)脆、破裂。

⑥將ELISPPOT板置于Biosys Bioreader4000 PRO自動(dòng)讀板儀內(nèi),調(diào)節(jié)好合適的參數(shù),半點(diǎn)計(jì)數(shù),并記錄斑點(diǎn)的各種參數(shù),作統(tǒng)計(jì)分析。

 

 

實(shí)驗(yàn)代做服務(wù):

ELISA試劑盒免費(fèi)代檢測(cè)

CCK8檢測(cè)

基因組DNA提取

 

蛋白相互作用分析

Western Blot

免疫組化

熒光定量PCR

動(dòng)物模型服務(wù)

流式細(xì)胞檢測(cè)

ROS氧化分析

激光共聚焦

DNA甲基化實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞劃痕

鈣離子濃度檢測(cè)

掃描電鏡實(shí)驗(yàn)

microRNA測(cè)序

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

探針合成

ATP/ADP檢測(cè)

石蠟/冰凍切片

定點(diǎn)突變

線粒體膜電位(MMP)檢測(cè)

細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

藥理毒理動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

 

免疫共沉淀

真核表達(dá)載體構(gòu)建

染色質(zhì)免疫沉淀CHIP

非標(biāo)定量(Label-free)實(shí)驗(yàn)



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