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021-65232515
產(chǎn)品型號:
所屬分類(lèi):免疫學(xué)實(shí)驗
產(chǎn)品時(shí)間:2023-10-12
簡(jiǎn)要描述:western blot服務(wù)收費標準/服務(wù)周期/提供結果:歡迎咨詢(xún)詳談,我們會(huì )根據您的方案及需求制定詳細的服務(wù)協(xié)議。更多實(shí)驗技術(shù)服務(wù)請瀏覽網(wǎng)站其他內容,或來(lái)電詳詢(xún)!
提供商: 上海研謹生物
服務(wù)名稱(chēng): western blot服務(wù)
規格: 實(shí)驗服務(wù)
實(shí)驗步驟:
一、試劑準備
1. SDS-PAGE試劑: 見(jiàn)聚丙烯酰.胺凝膠電泳實(shí)驗。
2.勻漿緩沖液: 1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml; 10%SDS 6.0 ml; β-巰基Z醇
0.2 ml; ddH2O 2.8 ml.
3.轉膜緩沖液:甘氨酸29g; Tris5.8g; SDS 0.37 g;甲醇200 ml;加ddH20定容至
1000 ml.
4.0.01 M PBS(pH7.4): NaCl8.0g; KC10.2 g; Na2HPO4 1. 44 g; KH2PO4 0.24 g;
加ddH20至1000ml。
5.膜染色液:考馬斯亮蘭0.2g;甲醇80 ml;乙酸2 ml; ddH2O118 ml。 包被液(5%脫
脂奶粉,現配) :脫脂奶粉1.0 g溶于20 m的0.01 M PBS中。
6.顯色液: DAB 6.0 mg; 0.01 M PBS 10.0ml; 硫酸鎳胺0.1 ml; H202 1.0 μl。
二、蛋白樣品制備
1.單層貼壁細胞總蛋白的提取
(1)倒掉培養液, 并將瓶倒扣在吸水紙上使吸水紙吸干培養液(或將瓶直立放置一
釓使殘余培養液流到瓶底然后再用移液器將其吸走)。
(2)每瓶細胞加3 ml 4°C預冷的PBS (0.01M pH7.2~7.3)。平放輕輕搖動(dòng)1 min洗滌
細胞,然后棄去洗液。重復以上操作兩次,共洗細胞三次以洗去培養液。將PBS棄凈
后把培養瓶置于冰上。
(3)按1m 裂解液加10 μl PMSF (100 mM),搖勻置于冰上。(PMSF 要搖勻至無(wú)結晶
時(shí)才可與裂解液混合。)
(4)每瓶細胞加400μ含PMSF的裂解液,于冰上裂解30 min,為使細胞充分裂解培養
瓶要經(jīng)常來(lái)回搖動(dòng)。
(5)裂解完后,用干凈的刮棒將細胞刮于培養瓶的一側(動(dòng)作要快), 然后用槍將細
胞碎片和裂解液移至1.5 mI離心管中。(整個(gè)操作盡量在冰 上進(jìn)行。)
(6)于4°C下12000 rpm離心5 min。(提前開(kāi)離心機預冷)
(7)將離心后的.上清分裝轉移倒0.5 m的離心管中放于- 20°C保存。
2.組織中總蛋白的提取
(1)將少量組織塊置于1 ~ 2 m勻漿器中球狀部位,用干凈的剪刀將組織塊盡量剪
碎。
(2)加400 μL單去污劑裂解液裂(含PMSF)勻漿器中,進(jìn)行勻漿。然后置于冰上。
(3)幾分鐘后再碾一會(huì )兒再置于冰上, 要重復碾幾次使組織盡量碾碎。
(4)裂解30 min后,即可用移液器將裂解液移至1.5 mI離心管中,然后在49C下12000
rpm離心5 min,取上清分裝于0.5 mI離心管中并置于- 20°C保存。
3.加藥物處理的貼壁細胞總蛋白的提取
由于受藥物的影響,一些細胞脫落下來(lái),所以除按1操作外還應收集培養液中的細
胞。以下是培養液中細胞總蛋白的提取:
(1)將培養液倒至15 m|離心管中,于2500 rpm離心5 min.
(2)棄上清,加入4 ml PBS并用槍輕輕吹打洗滌,然后2500 rpm離心5 min。棄上清
后用PBS重復洗滌--次。
(3)用槍洗干上清后,加100 μL裂解液(含PMSF) 冰上裂解30 min,裂解過(guò)程中要經(jīng)
常彈一彈以使細胞充分裂解。
(4)將裂解液與培養瓶中裂解液混在一起49C、 12000 rpm離心5 min,取上清分裝于
0.5 mI離心管中并置于- 20C保存。
三、蛋白含量的測定
1.制作標準曲線(xiàn)
(1) 從- 20°C取出1 mg/ml BSA, 室溫融化后,備用。
(2)取18個(gè)1.5 mI離心管, 3個(gè)一組,分別標記為0 mg, 2.5mg, 5.0mg,10.0 mg,
20.0mg, 40.0mg。
(3)按下表在各管中加入各種試劑。
(4)混溝后,室溫放置2 min。在生物分光光度計(Bio-Photometer, Eppendorf).
上比色分析。
2.檢測樣品蛋白含量
(1)取足量的1.5ml離心管,每管加入4°C儲存的考馬斯亮藍溶液1ml。 室溫放置
30 min后即可用于測蛋白。
(2)取一管考馬斯亮藍加0.15 mol/L NaCI容液100 ml,混勻放置2分鐘可做為空白樣
品,將空白倒入比色杯中在做好標準曲線(xiàn)的程序下按blank測空白樣品。
(3)空白樣品,用無(wú)水乙醇清洗比色杯2次(每次0.5mL),再用無(wú)菌水洗- -次。
(4)取一管考馬斯亮藍加95 ml 0.15 mol/L NaCI NaCI溶液和5mI待測蛋白樣品,
混勻后靜置2 min, 倒入扣干的比色杯中按sample鍵測樣品。
注意:每測一個(gè)樣品都要將比色杯用無(wú)水Z醇洗2次,無(wú)菌水洗一次。 可同時(shí)混合好
多個(gè)樣品再一起測,
這樣對測定大量的蛋白樣品可節省很多時(shí)間。測得的結果是5mI樣品含的蛋白量。
四、SDS- PAGE電泳
1.清洗玻璃板
一只手扣緊玻璃板,另一只手蘸點(diǎn)洗衣粉輕輕擦洗。兩面都擦洗過(guò)后用自來(lái)水沖,
再用蒸餾水沖洗干凈后立在筐里晾干。
2.灌膠與上樣
(1)玻璃板對齊后放入夾中卡緊。然后垂直卡在架子上準備灌膠。(操作時(shí)要使兩
玻璃對齊以免漏膠。)
(2)按前面方法配10%分離膠,加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。灌膠時(shí),可用10m
槍吸取5m膠沿玻璃放出,待膠面升到綠帶中間線(xiàn)高度時(shí)即可。然后膠上加一層
水,液封后的膠凝的更快。(灌膠時(shí)開(kāi)始可快一些,膠面快到所需高度時(shí)要放慢速
度。操作時(shí)膠-定要沿玻璃板流下,這樣膠中才不會(huì )有氣泡。加水液封時(shí)要很慢,
否則膠會(huì )被沖變型。)
(3)當水和膠之間有一條折射線(xiàn)時(shí),說(shuō)明膠已凝了。再等3min使膠充分凝固就可
倒去膠上層水并用吸水紙將水吸干。
(4)按前面方法配4%的濃縮膠,加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。將剩余空間灌滿(mǎn)濃
縮膠然后將梳子插入濃縮膠中。灌膠時(shí)也要使膠沿玻璃板流下以免膠中有氣泡產(chǎn)
生。插梳子時(shí)要使梳子保持水平。由于膠凝固時(shí)體積會(huì )收縮減小,從而使加樣孔的
上樣體積減小,所以在濃縮膠凝固的過(guò)程中要經(jīng)常在兩邊補膠。待到濃縮膠凝固
后,兩手分別捏住梳子的兩邊豎直向上輕輕將其拔出。
(5)用水沖洗-下濃縮膠,將其放入電泳槽中。(小玻璃板面向內,大玻璃板面向
外。若只跑一塊膠,那槽另- -邊要墊一塊塑料板且有字的- -面面向外。)
(6)測完蛋白含量后,計算含50ng蛋白的溶液體積即為上樣量。取出上樣樣品至
0.5m離心管中,加入5xSDS.上樣緩沖液至終濃度為1x。(上樣總體積-般不超過(guò)15
μl,加樣孔的大限度可加20μ樣品。)上樣前要將樣品于沸水中煮5min使蛋白
變性。
(7)加足夠的電泳液后開(kāi)始準備上樣。(電泳液至少要漫過(guò)內測的小玻璃板。 )用微
量進(jìn)樣器貼壁吸取樣品,將樣品吸出不要吸進(jìn)氣泡。將加樣器針頭插至加樣孔中緩
慢加入樣品。(加樣太快可使樣 品沖出加樣孔,若有氣泡也可能使樣品溢出。加入
下-個(gè)樣品時(shí),進(jìn)樣器需在外槽電泳緩沖液中洗滌3次,以免交叉污染。
3.電泳
電泳時(shí)間一般4 ~5h,電壓為40 V較好,也可用60 V。電泳至溴酚蘭剛跑出即可終止
電泳,進(jìn)行轉膜。
五、轉膜
1.轉一張膜需準備6張7.0~ 8.3 cm的濾紙和1張7.3 ~ 8.6 cm的硝酸纖維素膜。切
濾紙和膜時(shí)-定要戴手套,因為手上的蛋白會(huì )污染膜。將切好的硝酸纖維素膜置于
水上浸2 h才可使用。(用鑷子捏住膜的-邊輕輕置于有超純水的平皿里,要使膜浮
于水上,只有下才與水接觸。這樣由于毛細管作用可使整個(gè)膜浸
濕。若膜沉入水里,膜與水之間形成一-層空 氣膜,這樣會(huì )阻止膜吸水。
2.在加有轉移液的搪瓷盤(pán) 里放入轉膜用的夾子、兩塊海綿墊、-支玻棒、濾紙和浸
過(guò)的膜。
3.將夾子打開(kāi)使黑的一 面保持水平。在上面墊一張海綿墊,用玻棒來(lái)回搟幾遍以
搟走里面的氣泡。(一手搟另一手要壓住墊子使其不能隨便移動(dòng)。)在墊子上墊三層
濾紙(可三張紙先疊在一起在墊于墊子上),一手固定濾紙一手用玻棒搟去其中的氣
泡。
4.要先將玻璃板撬掉才可剝膠,撬的時(shí)候動(dòng)作要輕,要在兩個(gè)邊上輕輕的反復撬。
撬-會(huì )兒玻璃板便開(kāi)始松動(dòng),直到撬去玻板。(撬時(shí)一 定要小心,玻板很易裂。)除
去小玻璃板后,將濃縮膠輕輕刮去(濃縮膠影響操作),要避免把分離膠刮破。 小
心剝下分離膠蓋于濾紙上,手調整使其與濾紙對齊,輕輕用玻棒搟去氣泡。將膜蓋
于膠上,要蓋滿(mǎn)整個(gè)膠(膜蓋下后不可再移動(dòng))并除氣泡。在膜上蓋3張濾紙并除去
氣泡。后蓋上另一個(gè)海綿墊,搟幾下就可合起夾子。整個(gè)操作在轉移液中進(jìn)行,
要不斷的搟去氣泡。膜兩邊的濾紙不能相互接觸,接觸后會(huì )發(fā)生短路。(轉移液含
甲醇, 操作時(shí)要戴手套,實(shí)驗室要開(kāi)門(mén)以使空氣流通。)
5.將夾子放入轉移槽槽中,要使夾的黑面對槽的黑面,夾的白面對槽的紅面。電轉
移時(shí)會(huì )產(chǎn)熱,在槽的一邊放一塊冰來(lái)降溫。一般用60 V轉移2 h或40 V轉移3 h. .
6.轉完后將膜用1x麗春紅染液染5 min (于脫色搖床上搖)。然后用水沖洗掉沒(méi)染上
的染液就可看到膜上的蛋白。將膜晾干備用。
六免疫反應
1.將膜用TBS從下向上浸濕后,移至含有封閉液的平皿中,室溫下脫色搖床上搖動(dòng)
封閉1h。
2. 將抗用TBST稀釋至適當濃度(在1.5 m離心管中) ;撕下適當大小的-塊兒保鮮膜
鋪于實(shí)驗臺面上,四角用水浸濕以使保鮮膜保持平整;將抗體溶液加到保鮮膜上;從
封閉液中取出膜,用濾紙吸去殘留液后,將膜蛋白面朝下放于抗體液面上,掀動(dòng)膜
四角以趕出殘留氣泡;室溫下孵育1~2 h后,用TBST在室溫下脫色搖床上洗兩次,每次
10 min;再用TBS洗-次,10 min.
3.同上方法準備二抗稀釋液并與膜接觸,室溫下孵育1 ~2 h后,用TBST在室溫下脫
色搖床上洗兩次,每次10 min;再用TBS洗- -次, 10 min,進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應。
七、化學(xué)發(fā)光,影,定影
1.將A和B兩種試劑在保鮮膜上等體積混合; 1 min后,將膜蛋白面朝下與此混合液充
分接觸; 1 min后,將膜移至另一保鮮膜上,去盡殘液,包好,放入X-光片夾中。
2. 在暗室中,將1x顯影液和定影液分別到入塑料盤(pán)中;在紅燈下取出X -光片,用切
紙刀剪裁適當大小(比膜的長(cháng)和寬均需大1 cm) ;打開(kāi)X-光片夾,把X -光片放在膜
上,-旦放上,便不能移動(dòng),關(guān)上X光.陜,開(kāi)始計時(shí);根據信號的強弱適當調整曝光
時(shí)間,-般為1 min或5 min,也可選擇不同時(shí)間多次壓片,以達+*佳效果;曝光完
成后,打開(kāi)X-光片夾, 取出X-光片, 迅速浸入顯影液中顯影,待出現明顯條帶
后,即刻終止顯影。顯影時(shí)間-般為1~2 min (20~ 25°C),溫度過(guò)低時(shí)(低于
16°C) 需適當延長(cháng)顯影時(shí)間;顯影結束后,馬上把X-光片浸入定影液中,定影時(shí)
間-般為5 ~ 10 min,以膠片透明為止;用自來(lái)水沖去殘留的定影液后,室溫下晾
干。
應注意的是:顯影和定影需移動(dòng)膠片時(shí),盡量拿膠片一角,手指甲不要劃傷膠片,否
則會(huì )對結果產(chǎn)生影響。
八凝膠圖象分析
將膠片進(jìn)行掃描或拍照,用凝膠圖象處理系統分析目標帶的分子量和凈光密度值。
展開(kāi)
注意事項:
1.一抗、二抗的稀釋度、作用時(shí)間和溫度對不同的蛋白要經(jīng)過(guò)預實(shí)驗確定+*佳條
件。
2.顯色液必須新鮮配置使用,后加入H2O2。
3. DAB有致癌的潛在可能,操作時(shí)要小心仔細。
其他:
一、免疫反應
1.用0.01 M PBS洗膜,5 min x3次。
2.加入包被液,平穩搖動(dòng),室溫2 h。
3.棄包被液,用0.01 M PBS洗膜,5 minx3次。
4.加入一抗(按合適稀釋比例用0.01 M PBS稀釋,液體必須覆蓋膜的全部),49C 放
置12 h以上。陰性對照,以1%BSA取代-抗,其余步驟與實(shí)驗組相同。
5.棄-抗和1%BSA,用0.01 M PBS分別洗膜,5 minx4次。
6.加入辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的二抗(按合適稀釋比例用0.01 M PBS稀釋),平穩搖
動(dòng),室溫2 h。
7.棄二抗,用0.01 M PBS洗膜,5 minx4次。
8.加入顯色液,避光顯色至出現條帶時(shí)放入雙蒸水中終止反應。
實(shí)驗代做服務(wù):
ELISA試劑盒免費代檢測 | CCK8檢測 | 基因組DNA提取 | 蛋白相互作用分析 |
Western Blot | 免疫組化 | 熒光定量PCR | 動(dòng)物模型服務(wù) |
流式細胞檢測 | ROS氧化分析 | 激光共聚焦 | DNA甲基化實(shí)驗 |
細胞劃痕 | 鈣離子濃度檢測 | 掃描電鏡實(shí)驗 | microRNA測序 |
動(dòng)物實(shí)驗 | 探針合成 | ATP/ADP檢測 | 石蠟/冰凍切片 |
定點(diǎn)突變 | 線(xiàn)粒體膜電位(MMP)檢測 | 細胞生長(cháng)曲線(xiàn)的測定 | 藥理毒理動(dòng)物實(shí)驗 |
免疫共沉淀 | 真核表達載體構建 | 染色質(zhì)免疫沉淀CHIP | 非標定量(Label-free)實(shí)驗 |
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